1.流式細胞儀日常使用規范 　　【***** 使用手冊】流式細胞儀是一種對細胞進行自動分析和分選的裝置，依據參數測量試驗方法工作。流式細胞儀主要由流動室和液流系統、激光源和光學系統、光電管和檢測系統、計算機和分析系統4部分組成，目前在生物醫療領域有廣泛運用，主要用于分析細胞表面標志、分析細胞受體、分析腫瘤細胞的DNA、RNA含量、分析免疫細胞的功能。　　由于流式細胞儀比較昂貴且精密，為了確保不因為使用不當就很容易使液流部位出問題。　　1.一般來說，需要使用的所用溶液都應該進行過濾處理，此外樣本在上機前也要過濾，這么做事為了避免設備長時間使用時出現沉淀物而堵塞噴嘴；　　2. 開機后檢測樣本前，要用prime機檢查噴嘴的暢通狀況；　　3. 每日關機前移開托臂，用3～4管10%次氯酸鈉反復沖洗，不要讓有堵塞的噴嘴帶病運行，使用經過濾處理的H2O或PBS沖洗后才關機；　　4. 每天要倒空廢液瓶內的廢液，再注入少量的次氯酸鈉或消佳凈溶液，以防**生長；　　5. 鞘液瓶內的液體加至4/5容量并放置一夜，防止新加入的液體有氣泡產生而影響檢測結果。 2.巴玖講解流式細胞儀的基本結構

流式細胞計的基本結構流式細胞計主要由四部分組成。它們是：流動室和液流系統；激光源和光學系統；光電管和檢測系統；計算機和分析系統。　　（1）流動室和液流系統：流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學玻璃、石英等透明、穩定的材料制作。設計和制作均很精細，是液流系統的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號可發生振動。　　（2）激光源和光學系統：經特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發才能發出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據被激發物質的激發光譜而定。汞燈是常用的弧光燈，其發射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發的場合。氬離子激光器的發射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以647nm較強。免疫學上使用的一些熒光染料激發光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發生改變以適應需要即構成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續可調的激光，尤在590nm處轉換效率、高，約可占到一半。為使細胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細胞上的激光光斑直徑應和細胞直徑相近。因此需將激光光束經透鏡會聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來選擇激光的波長，調整反射鏡的角度使調諧到所需要的波長λ。為了進一步使檢測的發射熒光更強，并提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。　　（3）光電管和檢測系統：經熒光染色的細胞受合適的光激發后所產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。光電倍增管（PMT）為常用。PMT的響應時間短，僅為ns數量級；光譜響應特性好，在200～900nm的光譜區，光量子產額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續調節　，因此對弱光測量**有利。光電管運行時特別要注意穩定性問題，工作電壓要**穩定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因為光譜響應特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強光下穩定性比PMT好。　　從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內變化的信號以及代表生物學線性過程的信號，例DNA測量等。另一類是對數放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數關系。在免疫學測量中常使用對數放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽性三個亞群，它們的熒光強度相差1～2個數量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數放大器采集數據易于解釋。此外還有調節　便利、細胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優點。　　（4）計算機和分析系統：經放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數是和電信號的脈沖高度相對應的，也是和光信號的強弱相關的。對應道數年縱坐標通常代表發出該信號的細胞相對數目。多道分析器出來的信號再經模-數轉換器輸往微機處理器編成數據文件，或存貯于計算機的硬盤和軟盤上，或存于儀器內以備調用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的6～8個參數。存貯于計算機內的數據可以在實測后脫機重現，進行數據處理和分析，后給出結果。除上述四個主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。

3.流式細胞儀的十大應用 流式細胞儀的十大應用

　　1、DNA倍體分析　　DNA分析是流式細胞儀***初且是現在應用***廣檢測項目。由于惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同，存在異倍體細胞，所以現有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預后的關系。DNA含量檢測還可提供細胞周期方面的信息，這在細胞生物學中運用很廣泛。特別地，它可表示出細胞毒性**對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標志物標記同時進行，這樣在細胞混合培養中，可通常追蹤表達特異標志物的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學反應并發射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。　　在該領域Partec公司的 CyFlow PA是一枝獨秀。　　2、細胞生存能力實驗　　使用Heochest 33342染料與DNA特異性結合，后因細胞活力不同染料的結合程度也各異，故可評估細胞的活性度。　　3、計數外周血中檢測網織紅細胞　　使用TO染料能夠特異性地與RNA結合，結合系數高達3000，故具有很好的性價比。　　4、外周血、骨髓采集物中CD34陽性干細胞計數，臨床上用于骨髓移植前干細胞數理的測定。使用標準ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE標記CD34抗體，PE-CY5標記CD45抗體。　　5、交叉淋巴細胞、粒細胞毒實驗　　檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之間是否存在反應有著重要臨床意義，因為這種反應會導致移植后發熱、移植后肺損傷及免疫性粒細胞缺乏癥。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育后粒細胞上結合的人免疫球蛋白。FITC標記人免疫球蛋白抗體、PE標記粒細胞表面標志物、PE-CY5標記HLA抗體。　　6、血小板自身抗體檢測　　血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起各種臨床相關癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體。　　7、移植交叉配型　　原細胞毒實驗，主要用于避免移植物超急性排拆反應。流式細胞儀用于監測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預實驗。流式細胞儀因其高**性已成為該領域內的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體。　　8、檢測細胞經抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫**效果。流式細胞使用三色分析可監測淋巴細胞各亞群活化情況：FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體。　　9、細胞增殖狀態檢測　　核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況，在評估腫瘤預后有重要意義。為些標志物的檢測一般同細胞表面標志物同時檢測。FITC標記PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5標記細胞表面標志物。　　10、染色體分析　　流式細胞儀染色分析運用兩種特異性染料：Hoechest33258與核苷酸AT結合；Chromomycin A3與GC相結合。從而在雙參數坐標上根據染色體ATCG含量的不同識別各種染色體。平時進行的染色體分析耗時且需要操作者**經驗，而用流式細胞儀時可快速地識別出異常染色體，如加配分選系統可將這些異常染色體分選出來作進一步分析。