液相色譜柱的使用注意事項及再生 1 、色譜柱的使用說明：
（ 1 ）、 色譜柱使用前注意事項：
色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相。在使用前，**要注意色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應先用 10 ％左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出，堵塞色譜柱。
（ 2 ）、 流動相：
流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水***好是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動相再經(jīng)過 0.45μm 的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應該定期清洗或更換。
以常規(guī)硅膠為基質的鍵合相填料通常的 PH 值適用范圍是 2.0-8.0 ， BDS C18 適合于堿性化合物， PH 值適用范圍為 2.0-10.0 。當必須要在 PH 值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結束后立即用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗，并**置換掉原來所使用的流動相。
（ 3 ）、 樣品：
樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預處理柱（ SPE ）對樣品進行預處理；若樣品不便處理，要使用保護柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應嚴格脫水。
2 、色譜柱的保存
（ 1 ）、 反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：
使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應用 10% 的甲醇 / 水沖洗 30 分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗 30 分鐘。 注意：不能用純水沖洗柱子，應該在水中加入 10% 的甲醇，防止將填料沖塌陷。
（ 2 ）、 長期保存色譜柱：
如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度***好是室溫。
3 、色譜柱的再生
因為色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數(shù)的增加，會出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來說可能是柱效下降。
（ 1 ）、 反相柱的再生 ： 依次采用 20-30 倍的色譜柱體積的甲醇：水 =10 ： 90 （ V/V ），乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。
（ 2 ）、 正相柱的再生 ： 依次以 20-30 倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴格脫水。
4 、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法
色譜柱在使用中***常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬于正常現(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點：
（ 1 ）、色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；
（ 2 ）、色譜柱頭的填料被樣品污染；
（ 3 ）、色譜柱內緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶析出；
（ 4 ）、流動相 PH 值過大或過小使固定相結構破壞或溶解。
解決辦法如下：
（ 1 ）、如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在 10 ％的稀硝酸內超聲清洗 10 分鐘，后再用純水超聲 10 分鐘，重新裝入色譜柱。
（ 2 ）、如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修復后，重新安裝上柱頭螺絲。
（ 3 ）、如確定定是鹽結晶，用 10% 的甲醇 / 水沖洗色譜柱使柱內鹽**溶解，再換高濃度甲醇。
（ 4 ）、如果因 PH 值使用不當，很難恢復。
　　【***** 使用手冊】液相色譜是目前應用多的色譜分析方法，液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。液相色譜的流動相通常是各種低沸點溶劑和水溶液。它是影響分離的一個非常重要因素。在實際工作中，流動相的選擇和優(yōu)化是確定色譜分析的主要工作。
 　　選擇方法
 　　1、由強到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據(jù)出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
 　　2、三倍規(guī)則 ：每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
 　　3、粗調轉微調：當分離達到**程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
 　　脫氣方法
 　　1、吹氦脫氣法
 　　利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎**氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但氦氣價格較高，很少使用。
 　　2、加熱回流法
 　　此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。
 　　3、抽真空脫氣法
 　　此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa，即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實驗的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。
 　　4、超聲波脫氣法
 　　將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果差。
 　　5、在線脫氣法
 　　HPLC儀器均可配置專門的在線脫氣機。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。
 　　注意事項
 　　1、流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣，**微粒和灰塵。 在送液泵內，為了防止雜物(固體)進入流路，裝有吸濾器，但網(wǎng)孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過，這會導致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經(jīng)脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時，或壓力溫度變化時容易產(chǎn)生大量氣泡，會導致泵誤動作和輸液不暢，檢測器產(chǎn)生噪聲信號等。
 　　2、流動相恢復到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復到室溫前，基線水平很難穩(wěn)定，特別是發(fā)生漂移，也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務必注意。
 　　3、做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水，水相流動相需經(jīng)常更換，防止長菌變質。使用去離子水、針劑水、純凈水(炊用)并不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結果。
 　　4、流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的
 　　5、用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用后都要用水清洗流路，禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。
 　　6、若需要使用含鹽的流動相，使用前請務必過濾。并且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機相(有機相含量應不低于10%)的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
 　　7、進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性，避免因流動相不互溶而導致的緩沖鹽析出問題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時，用異丙醇置換系統(tǒng)內的儲存流動相后在接柱子。
 　　8、在更換兩種互不相溶的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然后在用正己烷做流動相時，**要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。
 　　9、儀器在短期(兩三天)不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應用甲醇。
 　　10、對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。
 　　11、當流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大，導致泵的流速降低。可適當提高流速使泵的壓力恢復正常即可。
 　　12、流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時，分析完了后，應立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
 　　13、用于檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。
 　　14、注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。        在液相色譜儀的日常分離分析工作中，其色譜柱的正確使用和維護**重要，色譜柱使用是否得當，直接影響色譜柱的壽命及液相色譜儀的使用效果，在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護儀器。　　1、柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。　　2、如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根 柱，這樣有助于延長柱子的壽命。　　3、避免壓力和溫度的急劇變化及**機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。　　4、應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)?*是水，反之亦然。　　5、如使用柱溫控制裝置時，應注意在通人流動相后才能升溫。　　6、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。　　7、選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。　　8、避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。　　9、保存液相色譜儀的色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。