**液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。

1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離試驗方法是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μM。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。

2．液液色譜法 使用將特定的液態物質涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離試驗方法是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。

涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少采用。現在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。

正相色譜法 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用***為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。

隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的PH值。但需要注意的是，C18和C8使用的PH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的PH值會使硅膠溶解，太低的PH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在PH 1.5~10范圍操作。

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　　自動進樣器的故障容易被發現，有時液相色譜儀系統出了故障而不能確定是否是進樣器故障，可以用手動進樣幾次，或用一臺好的自動進樣器代替，如排除了故障，說明自動進樣器有了問題。不同廠商的自動進樣器差異很大，除一些共性故障外，較好查閱操作手冊或與供應商聯系。

　　除自動進樣器機械、控制系統可能出現故障外，在操作及方法學方面也可能出現相應的問題，這里主要根據自動進樣器的設計特點，對試驗過程中可能出現的問題進行說明。

　　一、滯后體積

　　**液相色譜儀中滯后體積是指流動相混合器到柱頭的體積，包括溶劑混合器和混合器到柱頭之間連接管的體積，對于低壓混合系統，也包括泵體積。滯后體積較大可能導致實驗的重復性差、方法移植困難。通常的HPLC系統中，滯后體積一般在0.2mL～5mL之間，主要取決于裝置的設計。

　　滯后體積中較重要的部分為自動進樣器的定量環體積。只有定量環體積小于100μL時，其對滯后體積的影響才可以近似不計。當定量環體積較大時，這種影響將表現出來。例如，采用50μL的定量環時滯后體積為300μL，如果改用1mL定量環，滯后體積將變成1250μL，這種變化直接影響到色譜分離結果。在實際分離過程中，采用的色譜柱較細時，必須考慮滯后體積的影響，解決的辦法為更換較小的定量環，減小滯后體積。

　　二、樣品瓶過滿

　　如果樣品瓶過滿，在瓶蓋較緊、進樣量較大的情況下，可能會導致進樣重復性變差。其原因為樣品瓶中的樣品被抽出時，蓋緊的瓶蓋不能使空氣及時進入，造成部分真空。由于這種真空作用，注射器不能夠吸取足夠量的樣品體積。在**的情況下，對于揮發性稀溶液樣品，針內甚至會出現氣泡，影響分析工作的正常進行。

　　有些自動進樣器采用加排空針的方法克服這一問題，但這種方法并不常用。較簡單的解決辦法為不要使樣品瓶過滿。一般裝樣量在樣品瓶的1／2到3／4之間較為適宜。

　　三、進針深度的調節

　　樣品量足夠多時，不必考慮這一問題。但對于痕量分析而言，進針深度的調節問題將較為突出。理想的情況下可以使進針深入到接近樣品瓶底部，這樣可以較大限度地利用樣品。當可用的樣品體積有限時，可以采用微量樣品瓶以增加給定體積樣品的相對深度。如果進針過深，可能插入樣品瓶的底部，甚至導致針尖阻塞。如果進針深度不足，樣品只及針尖部分，針將不能抽取足夠量的樣品，部分空氣取而代之。

　　對于進針深度的調節，一般采用機械或電動的方法，目前大部分廠商可以在液相色譜儀色譜工作站上設置。無論采用哪種方法，實驗之前都必須認真調節，更換樣品瓶類型時還需要重新調整。